T.P.E - Lycée Saint Paul - Année 2015-2016 : La croissance des êtres vivants
Expérience : Croissance Bactérienne (E. Coli)
Les manipulations sont réalisées à la paillasse dans la zone de stérilité autour d’un bec bunsen au laboratoire du LBCM, Laboratoire de Biologie et de Chimie Marines. On dispose d’une préculture de la souche bactérienne Escherichia coli obtenue par ensemencement du même milieu Luria Bertani pendant 18h à 37°C (en 18h environ 108 à 109 bactéries/mL de milieu).
On introduit stérilement 1mL de cette préculture à 60mL de milieu nutritif stérile LB (Luria-Bertani) dans un erlenmeyer à l’aide d’une pipette stérile graduée à usage unique. L’erlen est ensuite placé dans l’incubateur à 37°C sous agitation. La pipette contaminée est déposée dans le récipient pour déchets contaminés.
On renouvelle la même expérience mais l’erlen est placé cette fois ci à 23°C. On règle le spectrophotomètre sur la longueur d’onde de 600nm (absorbance de la culture) et on règle le 0 sur 1mL de milieu stérile (sans bactérie). On prélève stérilement au bec bunsen 1mL du milieu de culture à l’aide d’une pipette stérile graduée que l’on dépose dans une cuve spectrophotométrique à volume réduit (1 mL). On place cette cuve dans le spectrophotomètre et on mesure l’absorbance. On jette la cuve dans le récipient de déchets infectieux. On renouvelle le prélèvement et les mesures toutes les 20 minutes.
Fig[4] Division de la bactérie Esherichia Coli (x58 000)
On voit la division en cours avec formation du septum (séparation). On voit l’ADN du chromosome qui est dupliqué (partie en clair appelée nucléoïde mais pas de vrai noyau)
Fig[3] Suivi de la croissance
1)
Après inoculation du milieu, les bactéries sont en phase de latence: il s’agit d’une phase d’adaptation au milieu: les bactéries se préparent à utiliser les nutriments pour se multiplier.
2)
Les bactéries ne commencent pas leur division simultanément : par conséquent, certaines sont en division alors que d’autres sont encore en latence. On observe donc sur la courbe une phase intermédiaire appelée phase d’accélération.
3)
Les bactéries entrent en division bactérienne: cette division se fait par fission binaire ou scissiparité : une cellule mère donne après un cycle complet de division 2 cellules filles identiques. Les bactéries sont en phase exponentielle de croissance.
Le temps nécessaire à une division complète est appelé temps de génération ou g (exprimé en minutes). Il peut être déterminé sur le graphique (On prend une absorbance puis son double et on rapporte sur l’axe des abscisses). Dans notre expérience le temps de génération est de 35 minutes à 37°C et beaucoup plus long à 23°C. On constate l'absence de croissance à 4°C pour cette bactérie mésophile.
4)
On observe une phase de déccélération, certaines bactéries poursuivant leur division et d’autres étant déjà en phase stationnaire.
5)
Après 220 minutes environ, les divisions s’arrêtent : les bactéries ont épuisé les nutriments du milieu, c’est la phase stationnaire.
Fig[5] Spectrophotomètre UV -Visible
Fig[6] Incubateur à 37°C, Agitation 95 rpm (round per minute)
Par cette expérience concrète nous pouvons analyser avec plus de facilité le lien mathématique qui présente la croissance des bactéries.
Quelques images de notre expérience :
